第1节. 使用本地 Blast 应用

blast 工具用来进行序列相似性比对。常见的使用是通过访问 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，使用基于 Web 及面的 blast 工具，调用 NCBI 相应的序列数据库来进行比对。此外在 NCBI 很多工具集里。

注解

blast 工具可以进行序列相似性比对。在 NGS 数据分析中经常会被使用到，特别是一些工具中需要使用 blast 来作序列比对。拿到测序完成的草图后，因为基因组数据较大，连接NCBI网站往往又非常缓慢，所以要做 Blast 比对的话都需要做 Local Blast。这里介绍2个方式来实现：

  1. 用命令行进行 Blast
  2. 快速构建 Blast Web 服务

1. 使用本地 Blast

blast 和 ncbi_blast+ 这2个程序集容易搞混。NCBI 最早在1989年创建 Basic Local Alignment Search Tool 工具，沿用至2009年无论是命令行工具或是在线程序，都称呼其为blast。2009年 NCBI 鉴于 blast 的一些不足，重新开发了新的 ncbi_blast+ 命令行工具，新的 ncbi_blast+ 工具在速度上有了提升，在输入输出上也更为灵活。

目前 Blast 工具最新版是2012年发布的2.2.26（已经暂停版本更新并不做进一步支持），而 ncbi_blast+ 目前一直在更新。要区分2者也很简单，blast 是通过 blastall -p 的方式调用子程序来比对搜索的，而 blast+ 则是直接使用 blastn 或 blastp 等子程序来比对搜索。另外前者用 formatdb 程序来格式化数据库，后者用 makeblastdb 程序来格式化数据。

1.1 Blast

Blast的下载与安装

# 安装 Ubuntu 编译包。
~$ sudo apt-get install blast2

# 或者直接下载NCBI Linux预编译包，并解压缩安装
~$ wget ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/legacy/2.2.26/blast-2.2.26-x64-linux.tar.gz
~$ tar zxvf blast-2.2.26-x64 -C ~/app
~$ sudo ln -s ~/app/blast-2.2.26-x64/blastall /usr/local/sbin

运行 Blast

Blast 通过调用 blastall 这个程序来调用不同算法和程序实现序列比对。在命令行中输入 blastall ，会打印出一份参数列表。你也可以使用 man blast 来查看 Blast 工具的用户手册。

~$ blastall

参数说明：

-p: 指定要运行的 blast 程序。可以调用的有:
    blastp             将氨基酸序列与蛋白质数据库比对
    blastn             将核酸序列与核酸数据库比对
    blastx             将核酸序列翻译成蛋白序列后与非冗余(nr)蛋白质数据库比对
    psitblastn
    tblastn
    tblastx
-d: 指定要调用数据库，默认值是非冗余(nr)数据库。本地 Blast 比对一般来说都是调用 formatdb 格式化的数据库。
-i: 输入，默认值是终端输入，也可以使用文件的方式，比如 -i seq.fasta
-o: 输出，默认值是终端打印输出，也可以使用文件的方式，比如 -o result.txt
-e: 期望值。
-T: 输出文件格式，默认值为F(False)，想输出HTML格式的可以用 -T T
-M: 矩阵算法选择，默认值是 BLOSUM62
-n: 如果想使用MegaBlast，就设置 -n T
-b: 数据库中的比对结果显示条目数，默认是250条记录。
-m: 比对结果的输出显示方式，值为0~11，默认是0。各个数字含义见下表。
数值 代表含义
0 pairwise
1 query-anchored showing identities
2 query-anchored no identities
3 flat query-anchored, show identities
4 flat query-anchored, no identities
5 query-anchored no identities and blunt ends
6 flat query-anchored, no identities and blunt ends
7 XML Blast output
8 tabular
9 tabular with comment lines
10 ASN, text
11 ASN, binary [Integer]

其他参数参见man blast。

应用举例:

Local blast例子：获得一条大肠杆菌序列 myseq.fasta，要和 EDL933 进行比对。首先下载 EDL933 的基因组数据，并格式化作为本地数据库，然后使用 blastn 对序列进行比对。

# 使用 edirect 工具的 efetch 下载 EDL933 基因组数据
~$ efetch db=nuccore -format=fasta -id=AE005174 > AE005174.fasta
# 使用 blast 的 formatdb 工具将 EDL933 基因组数据格式化成用于比对的数据库格式
~$ formatdb -i AE005174.2.fasta -o T -p F
# 调用 blastn 的方式比对 myseq.fasta 和 EDL933 序列
~$ blastall -i myseq.fasta -d AE005174.2.fasta -p blastn

1.2 NCBI_blast+

目前 NCBI_blast+ 最新版为 v2.4.0。

下载安装 NCBI Blast+

# 安装 Ubuntu 编译包
~$ sudo apt-get install ncbi-blast+

# 直接在 NCBI 官方 FTP 站点下载预编译包解压缩安装
~/tmp$ wget ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/blast+/2.4.0/ncbi-blast-2.4.0+-x64-linux.tar.gz
~/tmp$ tar zxf ncbi-blast-2.4.0+-x64-linux.tar.gz

构建数据库

~$ makeblastdb -in data/database.fasta -dbtype nucl -parse_seqids

应用举例:

NGS 测序时为了保证 DNA 质量，往往会对物种进行鉴定，采用 16s rDNA 测序的方法。公司给了一堆拼接的txt文件，里面内容是不同物种样本的 16s rDNA 序列。当样本量很大，比如1000条时，如果一条条去 NCBI 上比对也是浪费精力和时间。可以用 local blast 来批量处理。首先下载各个目的物种的16s rDNA序列，并将其格式化成数据库。

# 生成结果报告
~$ for i in *.txt; do blastn -db database.fasta -query $i -outfmt 6 >> result; done

http://www.personal.psu.edu/iua1/courses/files/2014/lecture-12.pdf

2. Local Blast 使用 nr 数据库

2.1 下载 NCBI nr 数据库

~$ nohup update_blastdb.pl nt nr > log &
~$ blastn -query myseq.fa -db nt -outfmt 11 -out result

3. 构建自己的 blast web 服务

3.1 blastkit

blastkit 是一个包含webserver等工具的blast工具集。

安装依赖包

~$ sudo pip install pygr
~$ sudo pip install whoosh
~$ sudo pip install git+https://github.com/ctb/pygr-draw.git
~$ sudo pip install git+https://github.com/ged-lab/screed.git
~$ sudo apt-get -y install lighttpd

对lighttpd webserver进行配置

~$ cd /etc/lighttpd/conf-enabled
~$ sudo ln -fs ../conf-available/10-cgi.conf ./
~$ sudo echo 'cgi.assign = ( ".cgi" => "" )' >> 10-cgi.conf
~$ sudo echo 'index-file.names += ( "index.cgi" ) ' >> 10-cgi.conf
~$ sudo /etc/init.d/lighttpd restart

本地安装 Blast

~$ cd tmp
~/tmp$ wget ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/executables/legacy/2.2.26/blast-2.2.26-x64-linux.tar.gz
~/tmp$ tar xzf blast-2.2.26-x64-linux.tar.gz -C ~/app
~/tmp$ sudo cp ~/app/blast-2.2.26/bin/* /usr/local/sbin
~/tmp$ sudo cp -r ~/app/blast-2.2.26/data /usr/local/blast-data

安装 blastkit

~/tmp$ cd ~/app
~/app$ git clone https://github.com/ctb/blastkit.git -b ec2
~/app$ cd blastkit/www
~/app/blastkit/www$ sudo ln -fs $PWD /var/www/blastkit
~/app/blastkit/www$ mkdir files
~/app/blastkit/www$ chmod a+rxwt files
~/app/blastkit/www$ chmod +x /root
~/app/blastkit/www$ cd ..
~/app/blastkit$ python ./check.py

如果安装顺利，就会提示一切已经准备完毕。接下来要准备数据。

~$ cp /mnt/assembly/ecoli.21/contigs.fa ~/app/blastkit/db/db.fa
~$ cd ~/app/blastkit
~$ formatdb -i db/db.fa -o T -p F
~$ python index-db.py db/db.fa